Editorial: Women in veterinary experimental and diagnostic pathology: 2021

The percentage of women participating in different professional sectors has risen over the last decades. The gender dimension is attracting special attention worldwide, and special measures are being undertaken to promote the incorporation and recognition of the contribution of women to different fields and levels, including legislation and policies..

Caracterización de células mesenquimales de ovino infectado con scrapie

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son enfermedades neuro-degenerativas sin tratamiento posible. En las últimas décadas se han desarrollado modelos celulares tanto para el estudio de los mecanismos moleculares de la enfermedad como para su posible aplicación en el diagnóstico precoz y para la evaluación de tratamientos in vitro. Sin embargo, existen muy pocos modelos celulares capaces de multiplicar la proteína prión patológica, la mayoría son derivados murinos que requieren la adaptación previa del aislado priónico en ratón antes de su multiplicación. Uno de los objetivos principales del presente estudio consistió en desarrollar un modelo celular que permitiera estudiar el scrapie en células procedentes del hospedador natural de la enfermedad, la especie ovina. Para ello se han estudiado y caracterizado las células mesenquimales (MSC) ovinas obtenidas a partir de sangre periférica y médula ósea. Se ha seleccionado la sangre periférica como tejido de fácil acceso, y la médula ósea por considerarse el lugar de mayor concentración de MSC en animales adultos. En las EET la proteína prión patológica se acumula principalmente en el sistema nervioso central (SNC) y es allí donde ejerce su acción patológica, por ello se ha analizado la plasticidad de las MSC ovinas para su diferenciación neurogénica. Por otra parte, se ha estudiado la susceptibilidad de estas células frente a la infección con el agente de la enfermedad de scrapie. Además, las MSC se han propuesto como posible terapia para las EET por lo que el segundo gran objetivo de esta tesis consistió en analizar los efectos que la enfermedad pueda desencadenar sobre las características de las MSC y su posible infectividad. En este trabajo se describe por primera vez la posibilidad de aislar MSC a partir de sangre periférica de ovino. Tanto las MSC ovinas de este origen como las obtenidas a partir de médula ósea expresan proteínas y transcritos de marcadores de superficie característicos de células mesenquimales. Tal y como se ha descrito en otras especies, se ha observado gran variabilidad individual de las MSC ovinas, que parece afectar tanto a la capacidad de diferenciación como a la plasticidad de estas células. Las MSC ovinas expresan la proteína prión celular y son susceptibles a la infección con aislados priónicos procedentes de animales afectados por scrapie, si bien, a diferencia de lo que ocurre en las MSC de ratón, no parecen propagar la proteína prión patológica. Sin embargo, la infección de BM-MSC con proteína priónica reduce la capacidad de proliferación de las MSC. Este hecho podría deberse a un efecto tóxico del prión y a la inducción de procesos apoptóticos. Estas características ratifican el potencial de las MSC ovinas como modelo celular en el hospedador natural de la enfermedad de scrapie para estudios de toxicidad de la proteína prión

Update on commonly used molecular typing methods for Clostridioides Difficile

This review aims to provide a comprehensive overview of the significant Clostridioides difficile molecular typing techniques currently employed in research and medical communities. The main objectives of this review are to describe the key molecular typing methods utilized in C. difficile studies and to highlight the epidemiological characteristics of the most prevalent strains on a global scale. Geographically distinct regions exhibit distinct strain types of C. difficile, with notable concordance observed among various typing methodologies. The advantages that next-generation sequencing (NGS) offers has changed epidemiology research, enabling high-resolution genomic analyses of this pathogen. NGS platforms offer an unprecedented opportunity to explore the genetic intricacies and evolutionary trajectories of C. difficile strains. It is relevant to acknowledge that novel routes of transmission are continually being unveiled and warrant further investigation, particularly in the context of zoonotic implications and environmental contamination

Autofagia en Enfermedades Priónicas

El scrapie, Encefalopatía Espongiforme Transmisible ovina y caprina, es una enfermedad neurológica que afecta al sistema nervioso central (SNC). El agente patógeno, PrPSc, se caracteriza por su alta resistencia a tratamientos físicos y químicos, su largo periodo de incubación y su acumulación en el SNC. La autofagia es un proceso intracelular mediado por lisosomas que limpia el citoplasma y degrada componentes dañados. Aunque se asocia a varias enfermedades neurodegenerativas, no hay muchos estudios que hayan analizado el efecto que dicho evento celular puede tener sobre el scrapie. En este trabajo se ha estudiado la inducción de la autofagia en un modelo murino de scrapie en distintas fases de la enfermedad. Se pretende comprobar si este modelo es adecuado para continuar la investigación en este ámbito. Se ha trabajado con ratones Tg338 que sobreexpresan el alelo VRQ del gen PNRP ovino. Sobre cortes de tejido cerebral se valoraron las lesiones histopatológicas de scrapie mediante la tinción con hematoxilina y eosina y la técnica PET Blot. Además, se realizaron estudios de expresión génica de seis marcadores (Atg5, Lc3, E2f1, Fbxw7, p62 y Gas5), seleccionados por su papel en la regulación de la autofagia. Para ello se empleó la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real(qPCR). Finalmente, mediante técnicas inmunohistoquímicas detectamos los marcadores LC3-II y p62. Tanto este marcaje como las lesiones histopatológicas se valoraron de forma semicuantitativa. La disminución de Atg5 (p=0.05) y el incremento de marcaje de p62 en la fase clínica sugieren una inhibición del proceso de autofagia en la fase tardía de la enfermedad. Además la similitud observada entre el modelo y las lesiones descritas en ovejas con scrapie clásico confirman la idoneidad del modelo murino Tg338 para la continuación de la investigación en esta línea

Aplicaciones de las células madre en el estudio y tratamiento de enfermedades priónicas: una revisión bibliográfica

Las enfermedades priónicas son un grupo de trastornos neurodegenerativos raros causados por la acumulación de una isoforma mal plegada (PrPSc) de la proteína prion celular (PrPC). Tanto el mecanismo de patogenicidad como las funciones de la propia proteína prion celular siguen siendo desconocidos, y debido a que estas enfermedades son de progreso rápido y mortales, existe una necesidad urgente y no satisfecha de desarrollar terapias que permitan frenar la propagación del prion. Se han propuesto muchos fármacos para combatir esta enfermedad, no obstante, no han resultado efectivos para paliar el daño cerebral. Por ello, una técnica que se presenta como buena candidata terapéutica es el empleo de las células madre, células no especializadas con capacidad de autorrenovarse y dar lugar a distintos tipos de células. Se sabe que estas células migran hacia sitios de daño cerebral y pueden diferenciarse en tipos de células neuronales específicos. Además del uso en la medicina regenerativa, las células madre se emplean también como modelo in vitro de las enfermedades priónicas y para el estudio de nuevas terapias farmacológicas.<br /

Caracterización de exosomas obtenidos de líquido cefalorraquídeo de ovino con scrapie y desarrollo de modelos celulares de la enfermedad

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan a animales y humanos y se caracterizan por la acumulación de una isoforma patológica (PrPSc) de la proteína prión celular (PrPC) en las células nerviosas. Con el fin de identificar potenciales biomarcadores para el diagnóstico de las EETs, se analizó la expresión de una batería de miRNAs que se han visto alterados en distintas enfermedades neurodegenerativas en líquido cefalorraquídeo (LCR) de ovino con scrapie, el prototipo animal de las EETs. Se observaron diferencias significativas entre animales enfermos y sanos para los niveles de miR-486-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p. Dado que los exosomas transportan entre células factores que favorecen el desarrollo de la patología, se realizaron los mismos análisis en la fracción exosomal del LCR, sin embargo, el aislamiento de exosomas no facilitó la detección de miRNAs desregulados dada su baja concentración. Por otro lado, se planteó implementar un modelo celular para el estudio de las EETs. Con este objetivo, se cultivaron, tanto en condiciones de crecimiento estándar como de diferenciación neurogénica, células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de la médula ósea de 3 ovejas con genotipos relacionados con una alta susceptibilidad al scrapie (ARQ/ARQ, VRQ/VRQ y ARQ/VRQ). Las MSCs sometidas a diferenciación neurogénica sufrieron ligeros cambios morfológicos y el descenso de la expresión del gen que codifica el factor de transcripción OCT4, asociado a la pluripotencia de las células madre. Además se vio alterada la expresión de genes asociados a la replicación priónica. Después se inocularon los cultivos con extracto cerebral de ovino con scrapie y se analizó la cantidad de proteína patológica en los mismos a distintos tiempos. Los cultivos mostraron distinta capacidad de replicación del prión y la inoculación produjo alteraciones en la proliferación y la expresión génica de las MSCs. Aunque hay que seguir investigando para confirmar el efecto del genotipo en la respuesta a la infección, los resultados obtenidos confirman el potencial de las MSCs como modelo para el estudio de las EETs

ASPERGILOSIS EN RAPACES. Estudio clínico-lesional, microbiológico y genético de los aislamientos.

La aspergillosis es una enfermedad de gran importancia en aves rapaces en libertad y en cautiverio, aunque es en esta situación donde se manifiesta especialmente. El principal agente causal es Aspergillus fumigatus, y con menor frecuencia, otras especies como A. flavus, A. niger, A. nidulans o A. terreus. No obstante, es una enfermedad multifactorial muy dependiente del ambiente y del manejo. Entre la sintomatología se incluyen los procesos respiratorios. Puede presentar curso agudo o crónico y la distribución de las lesiones puede ir de local a sistémica. En los últimos años están apareciendo especies crípticas de Aspergillus, es decir aquellas indiferenciables macroscópicamente en el cultivo microbiológico ni por el resto de pruebas diagnósticas clásicas. Además, presentan una mayor resistencia a antifúngicos. Por ello, el objetivo de este trabajo fue estudiar mediante técnicas moleculares casos de aspergilosis en rapaces en los cuales se aisló Aspergillus fumigatus, para detectar la presencia o no de posibles especies crípticas, y relacionarlas con los datos clínicos y las lesiones. Las muestras fueron remitidas desde el centro de Recuperación de Fauna silvestre de la Alfranca, de animales que presentaban síntomas y/o lesiones compatibles con la enfermedad. Se realizó un estudio histopatológico de las muestras, un estudio microbiológico, con aislamiento en medio agar Sabouraud con cloranfenicol y se hizo una identificación basada en características macroscópicas y microscópicas. Los cultivos microbiológicos fueron positivos a hongos en dos muestras, siendo compatibles con Aspergillus fumigatus. Se procedió a una identificación genética del agente implicado y así confirmar o descartar la identificación microbiológica. La secuenciación de un fragmento del gen de la beta-tubulina confirmó Aspergillus fumigatus como el agente causal de la patología en dos de las aves analizadas

Autofagia y biomarcadores en las enfermedades priónicas

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), o enfermedades priónicas, son un grupo de trastornos neurodegenerativos fatales que afectan a los animales y al hombre, caracterizados por la acumulación de una isoforma infecciosa (PrPSc) de la proteína prion celular (PrPc) en el sistema nervioso central (SNC). Utilizando el scrapie ovino como modelo animal de EET, en la presente Tesis Doctoral hemos analizado la posible implicación de la autofagia, un proceso intracelular fundamental que evita la acumulación de orgánulos dañados y proteínas mal plegadas, en la neuropatología asociada a estas enfermedades. Mediante estudios de expresión génica y determinación inmunohistoquímica de algunos de los marcadores de autofagia más utilizados en la actualidad, evaluamos la regulación de este proceso en ovino infectado de forma natural con scrapie clásico, en ovejas inoculadas experimentalmente con scrapie atípico y en el modelo murino transgénico Tg338, el cual sobreexpresa el alelo del gen ovino de la proteína prion (PRNP) más susceptible al scrapie clásico (VRQ).En estos modelos hemos identificado una disminución en los niveles de expresión de genes relacionados con la autofagia como ATG5 y un incremento del marcador p62, una proteína que se acumula en respuesta al deterioro degradativo autofágico, principalmente en las áreas del SNC más afectadas por la enfermedad. El análisis de las dos formas clínicas de scrapie, las cuales difieren en la distribución neuroanatómica tanto de las lesiones histopatólogicas como de los depósitos de PrPSc, nos ha permitido concluir, no sólo que la maquinaria autofágica se encuentra alterada durante el curso de la infección priónica, sino también que dicha alteración está relacionada con la neuropatología de la enfermedad y es en gran medida dependiente de las características lesionales particulares de la región del SNC analizada. Por otro lado, en la línea transgénica murina Tg338 hemos demostrado que la disfunción de la autofagia tiene lugar durante las fases tardías de la infección priónica. Aunque este modelo experimental muestra una regulación autofágica diferencial con respecto a ratones de tipo wild-type, probablemente debido a la sobreexpresión de la PrPc, en general, la línea murina Tg338 presenta una respuesta a la infección con scrapie clásico y una actividad autofágica similares a las observadas en el ovino, por lo que puede considerarse un método in vivo adecuado para estudiar la autofagia y las EETs de manera conjunta.En la actualidad, el único diagnóstico efectivo de las enfermedades priónicas se basa en la detección directa de la PrPSc en el SNC de manera post-mortem o en tejidos y fluidos periféricos mediante técnicas de amplificación in vitro. La detección de la PrPSc no se considera fiable para el diagnóstico in vivo, y algunas de las técnicas de amplificación son costosas y requieren de laboratorios especializados. En esta Tesis Doctoral hemos realizado diversos estudios dirigidos a la identificación de biomarcadores distintos a la PrPSc y a la validación de potenciales biomarcadores génicos ya identificados para proporcionar alternativas útiles a la metodología diagnóstica actual.Mediante RT-qPCR estudiamos la expresión de diez genes, cuya implicación en la propagación priónica había sido descrita previamente in vitro, en la médula oblongada de ovino con scrapie natural. De todos ellos, detectamos una regulación diferencial en BAMBI y CHGA, por lo que estos dos marcadores se analizaron posteriormente mediante inmunohistoquímica en el modelo ovino y en el modelo murino Tg338. Los cambios de expresión de estos genes tanto a nivel génico como proteico en ambos modelos de scrapie sugieren que podrían desempeñar un papel relevante en la neuropatología de las EETs in vivo, señalándolos a su vez como potenciales biomarcadores de la enfermedad. Además, las proteínas codificadas por BAMBI y CHGA muestran una relación, no sólo con la replicación del prion, sino también con la microgliosis reactiva asociada a estas enfermedades.Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) circulantes han sido propuestos como potenciales biomarcadores en una amplia variedad de patologías, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. En esta Tesis Doctoral hemos analizado, en plasma sanguíneo y líquido cefalorraquídeo (LCR) de ovino con scrapie, una batería de miRNAs que han mostrado cambios de expresión en otros modelos de EET, demostrando por primera vez alteraciones en los niveles de varios miRNAs circulantes en una enfermedad priónica de origen natural. En los animales infectados con scrapie detectamos un incremento de miR-342-3p y miR-21-5p en plasma, y de miR-342-3p, miR-146a-5p, miR-128-3p y miR-21-5p en LCR, por lo que estas moléculas pueden ser candidatas adecuadas para ser utilizadas como nuevos biomarcadores de la enfermedad. A pesar de que también analizamos sus perfiles de expresión en la fracción exosomal de ambos fluidos biológicos con el fin de concentrar la señal de estos miRNAs y así poder proporcionar un método de diagnóstico más sensible, la purificación de exosomas no mejoró la señal de amplificación de estas moléculas, o al menos, de la batería de miRNAs seleccionada.Finalmente, evaluamos la presencia de la PrPSc en exosomas circulantes mediante PMCA, ya que la circulación del prion a través del organismo podría estar facilitada por estas vesículas y, por tanto, podrían ser en parte responsables de la prionemia descrita en scrapie. En los exosomas aislados de plasma de ovino con scrapie no detectamos la presencia de la proteína patológica, por lo que la fracción exosomal de la sangre no parece estar implicada en la ruta hematógena de neuroinvasión en este hospedador, ni su análisis resulta adecuado para diagnosticar la enfermedad in vivo. Por el contrario, la detección de la PrPSc en los exosomas aislados de LCR podría representar un biomarcador útil para facilitar el diagnóstico in vivo de las EETs durante las últimas etapas de la enfermedad, ya que la amplificación de esta proteína fue positiva en la gran mayoría de muestras procedentes de animales en fase clínica.Mediante un compendio de seis estudios, en esta Tesis Doctoral se ha analizado la implicación de la autofagia en las EETs y se ha profundizado en la validación de potenciales biomarcadores de estas enfermedades mediante el estudio de genes codificantes de proteínas, miRNAs y exosomas circulantes, cumpliendo los objetivos planteados al inicio de la misma.<br /

Alteraciones de microRNAs en modelos murinos de enfermedades priónicas

Las enfermedades espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades priónicas constituyen un grupo de enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por una degeneración progresiva de tipo espongiforme las cuáles vienen acompañadas de un cuadro clínico que cursa con síntomas nerviosos que pueden conllevar la muerte del individuo y están causadas por unos agentes infecciosos denominados priones. Estudios recientes han demostrado que los miRNAs pueden utilizarse como potentes biomarcadores para el diagnóstico claro, rápido y eficaz de estas enfermedades evitando con ello su transmisión, ya que su expresión se ve alterada en la patología. En este trabajo se analizaron los cambios en la expresión mediante PCR cuantitativa (RT-qPCR) de una batería de miRNAs – cuyo cambio en la expresión se había identificado previamente por la técnica RNAseq - en médula espinal cervical (MEC) de ratones Tg501 y se analizó si estos cambios se repetían en el modelo murino Tg338. Además, se quiso analizar la posible correlación existente entre los niveles de expresión de los miRNAs elegidos y las lesiones histopatológicas de scrapie en estos últimos ratones, valorando el grado de espongiosis y el de depósito de proteína prion patológica PrPSc. Para los ratones Tg501 se confirmó una disminución en la expresión de dos miRNAs, - miR-342-3p y miR-223-3p – en animales infectados por scrapie. Sin embargo, en los ratones Tg338 tan sólo hubo un cambio significativo, la expresión del miR-667-3p era menor en los animales inoculados. No se observó correlación entre la expresión de estos miRNAs y las lesiones histopatológicas, lo que nos lleva a pensar que los miRNAs que han sido elegidos no tienen que ver con el con las lesiones típicas del scrapie pero sí que podrían estar involucrados en otros procesos biológicos como la neuroinflamación, la gliosis o la pérdida neuronal. Por tanto, en este estudio hemos determinado 3 miRNAs que presentan diferencias significativas, aunque dependientes del modelo murino, en su expresión. Sería necesario realizar más estudios para ver si podrían ser utilizados como posibles biomarcadores de la patología del scrapie